一、 溶剂贮存器
溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成,容量为1~2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。
二、 高压输液泵
高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。
高压输液泵通常有恒流泵额恒压泵
1.恒流泵
恒流泵又称机械泵，分机械注射泵和机械往复泵，其中机械往复泵应用最多。
2.恒压泵
能保持输出压力恒定，但输出流量随色谱系统阻力的变化而变化，保留时间重视性差。
目前，恒流泵正逐渐取代恒压泵。
梯度洗脱装置
梯度洗脱装置分为两类：一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，需一台泵即可。另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。
梯度洗脱装置的四种分类：
1.线性梯度
在某一段时间内连续而均匀地增加流动相强度。
2.阶梯梯度
流动相强度从低强度直接改变为较高强度。
3.高压梯度
利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。两种溶液在高压下混合。
4.低压梯度
使用一台高压输液泵，通过比例调节阀将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压输液泵中，溶液在常压（低压）下混合。
优点是使用一台高压输液泵，成本低；能实现二元以上梯度洗脱。
缺点是常压下混合往往容易形成气泡，通常需要配置在线脱气装置；浓度梯度范围较高压梯度窄。
液相色谱仪相关知识
液相色谱法是分析化学中发展最快、应用最广的一种分析方法，特别是高效液相色谱仪已经成为生命科学、材料科学、环境科学等方面必不可少的重要检测方法。现代科学技术的发展使得分析对象越来越复杂，分析要求越来越高，液相色谱的强大功能使其成为新世纪中解决生命科学、材料科学、环境科学等复杂体系发现难题的最有力的技术和方法。
高效液相色谱仪是在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论和技术而发展起来的。在高效液相色谱中，流动相与组分之间有一定的亲和力，分离过程的实现是组分、流动相和固定相三者间相互作用的结果，分离不但取决于组分和固定相的性质，还与流动相的性质密切相关，一般情况下，高效液相色谱仪的分析可在室温下进行，由于采用颗粒极细的固定相，柱内压降很大，加上流动相黏度高，因此必须采用高入口压，以此来维持一定的流动相线速。高效液相色谱仪对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的物质特别有利，它在医药、生化等方面具有非常重要的作用。
色谱柱的常见问题：
1.色谱柱污染：
目前,基层实验室多采用反相色谱柱,要减少色谱柱的污染最有效的办法是要纯化样品。凡是样品纯化得越干净,色谱柱的寿命就越长;反之,只有提取没有纯化的样品,色谱柱柱效就会大幅下降。一般来说,要提取纯化好的样品,最好的方法是用流动相溶解样品,这样,一方面能减少色谱图中的溶剂峰干扰,另一方面也能检查样品在流动相中的溶解性。如果样品进样后在流动相中沉淀,会堵塞进样器和柱头,甚至样品分解,出现鬼峰。如果出现样品与流动相不溶要设法改变溶解条件,可更换样品溶剂,或改进样品纯化处理的方法,或滤过去除不溶性物质。
2.色谱柱阻塞与对策
如果配有保护柱,应先去掉保护柱进行分析。如果色谱柱阻塞,可进行反冲洗。如果问题仍然存在,色谱柱可能被强保留的污染物损坏,建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在,可能是进口阻塞,更换入口处的筛板或更换色谱柱。如果必要,亦可更换色谱柱。
3.严格清场
清洗的过程是延长色谱柱寿命的关键,每次分析工作结束时,要做好清场工作。如果流动相是缓冲盐,先用5%甲醇水冲洗30 min以上；如果流动相是离子对,先用50%甲醇水冲洗30 min以上；如果流动相是酸性溶剂,先用纯水冲洗30 min以上,流速0.5 mL#min-1,最后过度到用色谱甲醇冲洗色谱柱,目的是冲去吸附在柱上的强保留组分。如果用甲醇-水为流动相也应这样冲洗色谱柱,在一定程度上可恢复柱效。
液相色谱仪 液相色谱仪 液相色谱仪相关知识_液相色谱仪
使用液相色谱仪的小伙伴肯定会遇到漏气和漏液的状况，流动相是造成液相色谱各种问题的主要源头。液相色谱常见的故障一是堵，二是漏。今天就这两部分别展开讨论(流动相以甲醇为例，色谱柱以C18为例) 。
惠州市华高仪器设备有限公司
查堵
首先，为何会堵？“堵”的表现现象就是柱压异常升高，直接原因就是流路不畅。堵塞的主要位置就是在色谱柱的前端，主要原因就是流动相里有杂质，杂质的主要来源就是细菌。
液相色谱仪
1、纯水中的细菌污染
首先我们要认识到，一般的国产甲醇其实不需要额外过滤处理，’华高仪器设备‘直接使用没有问题。即使是有些固态微粒杂质，也能在液相流路系统前端的过滤头上排除，真正容易引起问题的，是水中的细菌。新制备的纯水在室内放置几天就会长菌，而这些细菌虽然肉眼不可见，却足以堵塞柱填料颗粒的空隙，造成柱子很快报废。这就是在配制流动相时造成的细菌污染的原因，解决它的方法很简单，就是确保水的可靠性。
解决办法：
(1)理想的方式当然是购买实验室专用纯水机，既方便又可靠，质量也放心。
(2)成箱购买市售品牌纯净水，如500ml的怡宝或娃哈哈，这些水的质量足以应付液相色谱的要求。先随机抽取一瓶做一下细菌平板实验，待菌落数合格方可使用。这样每次只要单独开一瓶即可，也很方便。每次成本2元左右。这里特别指出一个细节：在绝大多数书本上，凡谈到配制流动相都会谈到后一个过滤的步骤。但是从我们长期使用的
实际效果来说，只要能保证水的质量，这一步完全可以也应当去除。
水有保证，可以不过滤？
(1)流动相过滤在理论上有好处，但是实际操作时由于不可能做到专瓶专用，反而容易造成的交叉污染，对于配比复杂的流动相影响更大。
(2)流动相过滤在经济成本上不划算。买一套过滤装置要6000多元，且过滤器公认是比较容易损坏的设备。主要是过滤片的成本太高，一片就要几十元。按一般液相柱的正常使用寿命计算，过滤片的成本会远远高于色谱柱的成本上升。
2、流动相的细菌污染
流动相刚开始不长菌，在使用时却产生了细菌污染。这主要是在使用多元液相色谱仪时的一种不良使用习惯造成的。举简单的例子：50%的甲醇水流动相，有两种使用方式。一种方式是在上机前就配好混合在一起，另一种方式是在流路A放纯甲醇，流路B放纯水。从单纯实验效果来说，后一种有明显的优点：首先是简单，不需要实验者另个计算配比混合，其次就是比例准确，能得到保留时间重复性极好实验效果。
但是，它有一个致命的缺陷，就是纯水在流动相瓶中几天时间就会长细菌(很多情况下不仅仅用纯水作流动相，而是用缓冲盐溶液，本身就是肥料，细菌长得更迅速)，一旦有细菌柱子就坏得很快。所以这种方式要求操作人员每次实验都要用新制备的纯水，更要求在每次实验后把水相换掉，换成甲醇冲洗干净，这一点在实际工作中很多人意识不强，就是意识到了但多次使用中总有一两次会遗漏，但是往往这一两次就足以产生致命的影响。因为液相色谱柱的堵塞是不可逆的。
所以，宁可牺牲小小的保留时间的重复性，也不要用纯水溶液作为流动相。从实际实验效果来说，我建议用10%的甲醇水代替水溶液(以前我做过不同比例甲醇水的细菌总数实验，在5%就基本可以抑菌，在10%及以上就可以完全杀菌了)，这样可以有效排除长细菌的隐患，既可作流动相，也可冲柱。就算是在配制流动相时会计算得麻烦一些，但是一次麻烦，终身受益。
3、不适当操作
(1)在更换零件时选择的型号有误，接口不是很匹配，在拧紧的时候产生变形而使得管路堵塞。
(2)样品处理液净化得不干净，长期会在六通阀和柱之间形阻塞不畅。
(3)在使用用手动六通阀时，有些人可能由于手劲小的原因，转动的不到位，于是造成流路形成死堵，压力快速升高超过警戒值。
(4)在使用金属管路作出废液管时，应当注意废液瓶中先放一些水，并把废液管的出口端结晶成块并造成堵塞。这种情况不常见，但却的确发生过。
4、查堵的方法
在发生“堵”的现象后，就需要找出原因，主要是什么位置发生了“堵”。绝大多数情况下，整个系统只会有一个地方发生堵塞。查堵的方法是从尾向前逆向分段拆开，仔细观察压力数值，如果某一个部件(柱子除外)装上和拆下时的压力差别很大，可发展变化判断。至于柱的堵塞，可以通过换同样规格的柱的压力是否一致来判断。
查漏
“漏” 分两种：漏液和漏气。漏液，液相色谱仪从流动相瓶到废液瓶之间的流路是一个全封闭体系，内部压力很高，但外部却能保证一滴不漏。如果某个部件发生漏液，那就是故障所在。漏液的原因分两种：
1、接触硬件不当
在更换零件如流路管或换柱时，换的接头接口不匹配，造成漏液。要注意不同公司的柱子接头很多是不同的，甚至同一家公司在不同时期生产的液相柱接头也有很大区别。当然选项用PEEK接头是一较好是一个较好的解决方法，不仅通用性好，而且靠手拧就能保证不漏液。即使是接口本身是匹配的，但是如果操作不当也会漏液，一种不当就是力度把握不好，拧得太紧或太松;
另一种不当就是致命的错误：滑丝，这往往是动手能力不太强，螺丝钉很少拧的工作者犯的错误，滑丝的后果不仅是漏液那么简单，常造成重要部件的报废。解决这个问题只能靠恶补基本功来实验，那就是拧螺丝。
2、使用仪器不当
只要互相有10%比例就不会出现这个问题。另一原因是在用缓冲液盐溶液(不论甲醇含量有多少)作流动相时，实验结束后没有换甲醇水冲洗，使得微渗的流动相干燥形成晶体造成。不过，输送泵漏液并不是非得马上修不可，冲洗干净并在以后的使用中多加小心一般都可以正常使用。检测器漏液是个很麻烦的事，一般都是吸收池的问题，更换的费用相当高。但是并不是说一定要马上更换，还可以从实际实验效果看能否凑合使用。
漏气，漏液是从内部向外漏，而漏气则是外部了的气体进入液相色谱仪的流路内部形成气泡。下面按流路的方向逐个部件分析产生气泡的原因和相应解决方法。
（1）过滤头
做油液时，在流路管中有不规则但持续的小气泡产生，这时考虑的是流动相有没有脱气(需要特别提醒即使是有了真空脱气机也是要先超声脱气的，起码可以减少脱气机的工作压力并提高工作效率)，如果已脱气，则要注意过滤头的污染也会造成这种现象。处理方法比较简单，拧下过滤头在稀硝酸中浸泡，超声半小时，洗净后装回去即可。
（2）透明流路管
指的是在过滤头和输送泵之间的那一段管路。这一个部分往往不是有点气泡，而经常是整个管中全是空气而操作人员却浑然不知，以致输送泵工作了半天才发现流动相瓶里的液体一点也没少。这也是我们常说的液相色谱仪至少一周要开机一次的原因(我们做液相一定要有“微渗”的概论)。如果长时间不用，这一段管路的液体会彻底干掉，而充满空气的管路和充满液体的管路不仔细看是分辨不出来的。这种情况对于输送泵很危险，因为泵从设计来说是输送液体而不是输送气体，内部的液体对于活塞来说起到了机油的作用，如果活塞杆还残存了一些缓冲盐，则极易拉伤，造成不可逆转的影响。
对于这种情况，要突出“预防为主”如：液相色谱使用人员要相对固定和稳定，工作中合理搭配资源，每台机一周至少一次实验，如长期不用起码每周要冲流动相2小时。养成良好的工作习惯很重要。
如果流路管中真漏气了怎么办？
我的建议是用外力使管路中充满液体。
具体如下：
1、找到流路管进入输送泵的接头。
2、拧下来。
3、用一干净洗耳球的对准管路的平整切口。
4、吸液体，看液面从流动相瓶里上升，至离洗耳球5cm左右时停止该动作。
5、快速把接头拧回输送泵上(这个过程可能会有少许流动相外泄，这是正常现象)。
6、开机，打开排液阀门，启动输送泵。
7、等排液管中流出的溶液没有气泡时，再关闭排液阀，仪器正常工作。
（3）输送泵和柱子
这些部分进了气泡一般不怕，冲掉就行。
（4）检测器
应该说，整个流路中只要有一个气泡都会在检测器上得到强烈的信号反映，检测器内部的气泡一般都能被冲走，但也有很难冲掉的残留气泡的情况。如果检测器内有残留气泡，会有特别明显的表现形式，就是在走基线时会时不时间隔出现直上直下信号很大的信号峰。这时先看普通流量能否冲走，如果冲不走，办法就是拆柱，把检测器直接连接到输送泵的出口，加大几部流量冲洗，则肯定能冲走气泡。
关闭返回